采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆出团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏热休克蛋白70(HSP70)基因全长cDNA序列,共2 224 bp,包括135 bp 5′非翻译区、1 932 bp阅读框以及157 bp 3′非翻译区[不包括Poly( A)]。阅读框共编码643个氨基酸,分子量计算值为70.53 kD,理论等电点为5.25。该HSP70基因在翻译区不含内含子,符合诱导型HSP70的特征。团头鲂HSP70氨基酸序列中含有HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等。同源性分析表明,团头鲂HSP70氨基酸序列与斑马鱼等脊椎动物的相似性高达84.0%以上,与无脊椎动物果蝇的相似性也高达73.4%。生物信息学分析显示,团头鲂HSP70基因所编码的蛋白质以亲水性区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点,无信号肽,无跨膜区域,为非分泌型蛋白;同时还含有众多的蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号转导与调控中发挥重要作用。该蛋白含有2个部分重叠的双向核定位序列,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,空间结构包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域。应用实时定量PCR研究高温(34 ℃)应激对团头鲂HSP70 mRNA表达的影响。结果表明,在热应激过程中肝脏HSP70 mRNA水平呈先升高后下降的变化趋势,说明该基因的表达受热应激调控,本实验克隆的序列为诱导型HSP70 cDNA。[中国水产科学,2009,16(5):635-648]    作者:明建华、谢骏、刘波等人。(南京农业大学无锡渔业学院,淡水渔业研究中心) |