近日，中国水产科学研究院长江水产研究所曾令兵研究员团队在鲤疱疹病毒2型酵母疫苗方面研究取得重要进展。研究论文“Protective immunity in gibel carp, Carassius gibelio of the truncated proteins of cyprinid herpesvirus 2 expressed in Pichia pastoris”于11月10日在Fish & shellfish immunology在线发表。长江所周勇助理研究员为论文第一作者，曾令兵研究员为论文通讯作者。

　　鲫是我国长江流域及南方地区广为养殖的淡水鱼类之一，其主要养殖品种异育银鲫因其食性杂、适应能力与繁殖能力强、抗逆性好以及味道鲜美、营养价值高等优点，而深受广大养殖者与消费者喜爱。但近年来，我国鲫鱼主养区域的病害问题日趋严重，养殖的异育银鲫暴发一种以出血为典型症状的疾病而大规模死亡，经济损失非常严重。经过多年研究确定导致养殖异育银鲫大规模死亡的是一种病毒性疾病。通过对患病异育银鲫肾脏、脾脏组织的超薄切片电镜观察、组织病理学、细胞培养试验及PCR等分子方法检测，证实引起异育银鲫大规模死亡的出血性疾病为鲫造血器官坏死症（Crucian Carp Hematopoietic Necrosis），其病原为鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）。由于CyHV-2对养殖鲫鱼的感染事件多有发生，故其致病机理和疫苗研发是近几年研究的重点。

　　长江所鱼病室通过对鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）ORF25、25C和25D基因抗原决定簇分析，设计特异性引物，将其截短基因定向克隆到酵母表达载体pPICZα B中，构建重组质粒并命名为pPICZα-tORF 25、pPICZα-tORF 25C和pPICZα-tORF 25D。将重组质粒转化到酵母菌株KM71中进行表达与筛选。通过免疫胶体金技术观察到表达的蛋白可吸附于鲫鱼脑细胞表面。将重组蛋白与鲫鱼脑细胞孵育后接种CyHV-2发现，tORF 25组 (104.1/ml) TCID50 低于tORF 25C组 (104.6/ml) 和 tORF 25D组 (105/ml) TCID50。将重组蛋白以20μg/尾剂量经背部肌肉注射免疫健康鲫鱼，免疫后白细胞介素11基因表达量明显增加，在免疫后第4天达到峰值，而补体C3基因在第7天达到峰值。血清中和试验结果表明，免疫tORF 25蛋白的鲫鱼最高抗体滴度为327，高于tORF 25C（247）和 tORF 25D（228）蛋白免疫的鲫鱼抗体滴度。攻毒感染试验结果显示，免疫tORF 25、tORF 25C和tORF 25D蛋白的鲫鱼相对存活率为75%、63%和54%。本研究为毕赤酵母表达的tORF 25、tORF 25C和tORF 25D蛋白作为潜在候选疫苗应用于CyHV-2的预防和控制奠定了前期基础。

图1 pPICZα-tORF 25，pPICZα-tORF 25C和pPICZα-tORF 25D载体构建示意图

图2 鲫鱼免疫CyHV-2截短蛋白后保护效率研究

（Zhou Yong, Jiang Nan, Ma Jie, Fan Yuding, Zhang Linlin, Xu Jin, Zeng Lingbing. Protective immunity in gibel carp, Carassius gibelio of the truncated proteins of cyprinid herpesvirus 2 expressed in Pichia pastoris [J]. Fish & shellfish immunology, 2015. 47(2): 1024-1031. doi:10.1016/j.fsi.2015.11.012. ）

（来源：鱼病室 周勇）